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Biotechnology & Applied Microbiology
聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 是一种广泛使用的塑料，由对苯二甲酸 (TPA) 和乙二醇 (EG) 聚合而成。
- Polyethylene terephthalate
- Biodegradation
- Hydrolases
- Chassis
一、介绍
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是人们生活中使用最广泛的合成塑料之一[ 1 ]。它由对苯二甲酸 (TPA) 和乙二醇 (EG) 通过酯键聚合而成 [ 2 ]。自20世纪PET首次用于生产一次性塑料瓶以来，受到世界范围的欢迎，成为人们生活中不可或缺的一部分[ 3 ]。由于 PET 对自然降解具有很强的抵抗力，因此鼓励对 PET 进行回收利用 [ 4 ]。目前，处理 PET 废弃物的主要方法包括填埋、焚烧以及物理和化学回收 [ 5 , 6]]。这些方法通常会对环境造成二次污染，消耗大量能源，既不经济也不环保。由于回收利用策略不当，塑料制品的机械性能强，造成土壤污染、海洋生态系统扰乱等严重的环境问题[ 7 ]。因此，PET 生物降解作为一种环境友好的替代方法受到了关注，与其他回收方法相比，它需要更温和的温度和更低的能耗 [ 8 , 9 ]。此外，降解单体可以很容易地回收利用，希望将 PET 转化为高价值的化学品。
1977 年，报道了几种商业脂肪酶和酯酶可以水解各种聚酯 [ 10 ]。从那时起，许多 PET 水解酶，例如脂肪酶、角质酶和酯酶，已被各种微生物发现并表征 [ 1 , 11 ]。2016 年，从废物回收站分离到了Ideonella sakaiensis 201-F6 [ 12 ]。发现它可以产生 PET 水解酶 (PETase) 和对苯二甲酸单羟乙酯 (MHET) 水解酶 (MHETase)，它们可以在 30°C 下将 PET 降解为中间产品。然后，对两种酶的结构进行了分析，并进行了一系列有效的酶修饰 [ 13 , 14 , 15 ], 16 , 17 ]，有效提高了两种酶的活性和稳定性。PETase和MHETase的发现和修饰为常温降解PET废物提供了重要依据。
合成生物学和代谢工程策略已应用于 PET 废物的生物降解和生物转化，特别是在 PET 水解酶的修饰、微生物底盘的优化和降解途径的重建方面。目前，一些细菌、真菌和海洋微藻已被报道为PET生物降解的良好微生物基质。全细胞生物催化剂已经能够实现PET的初始降解。TPA 和 EG 的生物转化途径已经确定。一些微生物已被设计为从 PET 单体生产高价值化学品，这是 PET 升级回收的一个重要发展方向。基于这些目前的进展，
2. PET 生物降解
在 PET 生物降解过程中，微生物首先附着在 PET 薄膜表面，然后分泌细胞外 PET 水解酶，与 PET 薄膜结合并启动生物降解过程 [ 18 , 19 ]。PET水解酶作用于PET的酯键，将其水解为TPA和EG，生成不完全水解产物，如MHET和对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)。在I. sakaiensis 201-F6 中，MHET在MHETase的作用下可进一步水解为TPA 和EG [ 12 ]。据报道，MHETase 对末端生成的 PET 膜具有水解活性，证明了该酶的外切 PETase 功能 [ 20]。PET 水解酶可以进一步水解 BHET，产生 MHET、TPA 和 EG [ 12 ]。TPA和EG可以用不同的微生物可以使用，并可以进一步代谢成三羧酸循环（TCA循环）中的产品[ 21，22，23，24，25，26，27，28，29 ]。此外，这些 PET 生物降解的中间产品和最终产品已被确定为 PET 水解酶的竞争性抑制剂 [ 30 , 31 ]。
2.1. 工程 PET 水解酶
水解酶，包括脂肪酶[ 31，32，33，34 ]，角质酶[ 35，36，37，38，39，40，41，42 ]，酯酶[ 43，44，45，46 ]，PETase [ 12 ]和MHETase [ 12]，已经确定可以降解 PET。其中，脂肪酶对PET的水解活性最低，主要是因为它们的催化中心被盖结构覆盖，限制了水解酶与底物PET的接触和催化作用。角质酶总是具有很强的PET水解能力，因为它们具有大的底物结合口袋，没有盖子结构，有利于PET与其活性中心的结合。然而，角质酶通常在高温（50-70°C）下降解 PET，而 PETase 和 MHETase 可以在 30°C 下高效且特异性地水解 PET [ 12]]。PETase和MHETase的发现有助于实现PET在常温下的高效生物降解。目前，对这两种酶的结构进行了广泛的研究，并出现了更多的高活性水解酶变体。
一种策略是设计结合口袋，这可以提高 PET 水解酶的特异性并增加酶和底物的有效吸附 [ 15 , 47 , 48 , 49 ]。我们的实验室之前专注于 PETase 与底物结合附近的六个关键氨基酸，并进行了定点突变。成功筛选了 R61A、L88F 和 I179F 突变体，与野生型 PETase 相比，酶活性分别增加了 1.4 倍、2.1 倍和 2.5 倍 [ 50 ]。席尔瓦等人。[ 51 ] 对来自Thermobifida fusca的角质酶进行修饰_0883通过定点诱变构建了单突变Ile218Ala和双突变Q132A/T101A，扩大了催化空间，提高了PET生物降解效率。陈等人。[ 52 ] 通过 PETase 的结构分析确定了独特的氨基酸 S214 和 I218，并指出它们与 W185 摆动和 β6-β7 环灵活性有关。这项研究有助于设计增加底物结合口袋灵活性的 PETase 突变体。
一些研究侧重于使用酶工程策略来提高 PET 水解酶的稳定性，以提高 PET 生物降解效率 [ 53 , 54 ]。添加Ca 2+或Mg 2+ [ 38 , 55 ]、引入二硫键和盐桥[ 56 , 57 ]和糖基化等方法均已被证明可以提高PET水解酶的稳定性。研究人员添加二硫键以提高叶枝堆肥角质酶 (LCC) 的热稳定性，并对底物结合附近的热氨基酸进行定点突变，获得组合突变 F243I/D238C/S283C/Y127G (ICCG) [ 53]。最后，90% 的 PET 塑料瓶碎片在 72°C 下降解 10 小时，这是迄今为止最有效的 PET 水解酶 [ 53 ]。
此外，通过工程化PET的水解酶增加了对PET的水解酶的底物可访问性也得到了广泛的研究[ 58，59，60 ]。据报道，纤维素分解热双歧杆菌的 Thc_Cut1 与里氏木霉的疏水蛋白（HFB4 和 HFB7）的融合表达可使PET 的水解效果提高 16 倍以上，而酶和疏水蛋白的混合物仅导致 4-至多增加倍数 [ 61 ]。
2.2. 工程 PET 生物降解底盘
大多数鉴定出的能够分泌PET水解酶的微生物是非模型微生物，由于其复杂的遗传背景，它们很难进行基因工程。此外，来自野生菌株的 PET 水解酶的表达水平不足以满足大规模降解的需求。因此，有必要开发利用模型微生物高效表达PET水解酶的重组表达系统。PET是由TPA和EG聚合而成的高分子聚合物，不能进入细胞，因此PET的体外酶解得到了广泛的研究。由于PET水解酶的纯化和制备过程耗时且成本高，因此有必要在细胞外有效表达PET水解酶以用于实际应用。76,77].
目前，一些微生物底盘如细菌、真菌、海洋微藻等已应用于PET水解酶的分泌和表达，已被研究证明是降解PET的有前景的底盘。几个全细胞生物催化剂已被设计成降低PET，其能够不仅避免酶纯化的复杂的步骤，而且在多步反应中重复使用，相比于自由基于酶的方法[ 78，79 ]。此外，还解决了环境因素影响酶活性降低，甚至酶失活的困难。下面总结了几种适用于PET生物降解的微生物底盘。
2.2.1. 细菌
大肠杆菌
大肠杆菌由于其遗传背景清晰、生长条件简单、高密度培养等优点，是生产重组蛋白的重要模式微生物[ 89 ]。在近年来，随着PET水解酶的连续发现，越来越多的酶已在所取得的异源表达大肠杆菌[ 12，14，16，50，53，69 ]。已经总结了在大肠杆菌中异源表达的 PET 水解酶[ 76 ]，这有助于进一步分析这些酶的晶体结构并探索 PET 的降解机制。
最近的研究表明，工程大肠杆菌可用作 PET 生物降解的全细胞生物催化剂。选择最佳信号肽是用于改进异源 PET 水解酶切片的常用策略。一项研究测试了来自大肠杆菌的 Sec 依赖和 SRP 依赖信号肽对分泌 PETase 的影响，并通过融合 SP LamB和 PETase成功生产了 6.2 mg/L PETase [ 80 ]。其他一些研究通过修饰信号肽来提高表达滴度和酶活性。通过随机诱变获得的进化信号肽 PelB (G58A) 已成功用于在大肠杆菌中表达异源 PETase，并使 PETase 分泌量提高 1.7 倍。81 ]。研究了信号肽 B1 的增强剂 (MERACVAV) 来介导 PETase 的排泄，最后，B1PelB 介导的 PETase 的排泄效率比 PelB 的排泄效率提高了 62 倍 [ 82 ]。
枯草芽孢杆菌
革兰氏阳性枯草芽孢杆菌具有分泌量高、生长快、无外膜等优点，与通常形成包涵体的大肠杆菌相比，被认为是分泌异源蛋白的优良微生物底盘[ 90 , 91 ]。此外，枯草芽孢杆菌对恶劣环境具有很强的抵抗力，它已被用来分泌可以降解许多污染物的蛋白质，这就是为什么它被认为是一种有前途的生物降解微生物底盘 [ 92 , 93 ]。
在 PET 生物降解方面，枯草芽孢杆菌已被设计为分泌 PET 水解酶。据报道，枯草芽孢杆菌168在其天然信号肽（SP PETase）的指导下，成功地将PETase分泌到培养基中。SP PETase被预测为双精氨酸信号肽，双精氨酸易位 (Tat) 复合物的失活使 PETase 的分泌量提高了 3.8 倍 [ 83 ]。另外两个PET水解酶（BhrPETase和LCC）也表示在枯草芽孢杆菌，和BhrPETase的表达滴度和LCC中的工程化的分子伴侣表达达到0.66克/ L和0.89克/升的枯草芽孢杆菌分别[42 ]。此外，优化了信号肽和启动子的组合以促进枯草芽孢杆菌WB600中PETase的表达，并且信号肽SP amy和弱启动子P43的组合被证明是最好的[ 84 ]。
嗜热细菌
大多数能够降解PET的水解酶，包括脂肪酶、角质酶和酯酶，在较高温度下具有更高的酶活性，而大多数能够产生异源PET水解酶的模型微生物的最佳生长温度通常为30-40°C。全细胞生物催化剂与某些仅在高温下起作用的 PET 水解酶不兼容 [ 94 ]。因此，需要一个嗜热表达系统来提高 PET 生物降解的效率 [ 36 , 95 ]。除了具有成熟基因操作平台的热纤梭菌（Clostridium thermocellum）外，大多数嗜热微生物通常难以进行基因改造[ 94 ]。C. 热纤已被设计用于木质纤维素生物转化 [ 96 ] 和生物燃料生产 [ 97 ]，这就是为什么它被认为是 PET 生物降解的潜在微生物底盘。
2.2.2. 菌类
除细菌外，一些酵母，包括潜在的巴斯德毕赤酵母和脂耶氏酵母，在PET的生物降解中使用进行了研究。P. pastoris具有强大的分泌表达系统和可扩展的发酵能力，已成为工业应用中蛋白质生产的常见菌株。研究人员已经表示BurPL（H344S / F348I）和PETase在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌，并指出，从生产的两种酶巴斯德毕赤酵母表现出更高的活性比在表达大肠杆菌因为蛋白质半衰期保护机制的P . 帕斯托里斯[ 52 , 103]。通过在巴斯德毕赤酵母表面展示 PETase 开发了一种全细胞生物催化剂，与纯化的 PETase 相比，PETase 的酶活性增加了 36 倍，形成高度结晶的 PET [ 86 ]。此外，这种全细胞生物催化剂可以重复使用七次而没有明显的活性损失，这有助于开发其他用于PET生物降解的全细胞生物催化剂[ 86 ]。考虑到P. pastoris进行N-连接糖基化的能力，有研究人员研究了糖基化对P. pastoris中表达的LCC的影响，发现LCC的动力学稳定性和活性都得到了提高[ 35 ]。解脂耶氏酵母也是用于生物修复的绝佳微生物底盘 [ 104 ]。研究人员分离出能够将 PET 转化为 MHET 的Y. lipolytica IMUFRJ 50682，并验证了 PET 单体可能在脂肪酶生产过程中充当诱导剂 [ 105 ]，这表明Y. lipolytica是一种潜在的 PET 生物降解微生物底盘。其他研究在Y. lipolytica Po1f 中表达了 PETase和来自脂肪酶的信号肽，并证实工程菌株可以将 BHET 和 PET 粉末水解成单体 [ 106]。表面展示系统和全细胞生物催化剂为实现 PET 水解酶的高效表达和促进 PET 生物降解提供了新的思路和策略 [ 77 , 107 , 108 ]。酵母与有效的遗传工具一起，已被用作生物降解和生物转化的重要微生物基质 [ 109 ]。
2.2.3. 海洋微藻
目前，现有的能够生产PET水解酶的天然和工程微生物底盘通常难以适应复杂的海洋环境，产生大量的PET废物。最近，一些海洋微藻已被用作 PET 生物降解的底盘 [ 110 ]。据报道，一种光合微藻三角褐指藻被设计为能够将 PETase 突变体分泌到培养基中的底盘，并且重组 PETase 能够有效降解不同的底物，包括 PET 薄膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己基二甲基对苯二甲酸酯) (PETG) 薄膜和 PET 碎纸，在 30 °C 或什至在中温温度 (21 °C) [ 87 ]。此外，Chlamydomonas reinhardtii这种绿藻也被成功改造为产生具有降解活性的 PETase，在培养 4 周后，PET 膜上出现了化学和形态变化 [ 88 ]。作为在盐水环境中生物降解 PET 废物的环保底盘，海洋微藻在未来生物技术应用中具有潜在的 PET 污染海水降解潜力 [ 87 ]。
This entry is adapted from the peer-reviewed paper 10.3390/microorganisms10010039
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