Как только дифференцировка клеток РПЭ завершена [ 82 , 83 ], клетки выходят из клеточного цикла и сохраняются на протяжении всей жизни, делясь редко или не делясь вообще. Считается, что клетки РПЭ млекопитающих и человека представляют собой терминально дифференцированные постмитотические неделящиеся клетки. Однако есть данные, что у грызунов клетки РПЭ на периферии слоя способны к пролиферации [ 57 , 84 ]. Известно также, что периферические клетки РПЭ макак могут включать 3Н-тимидин, что указывает на их пролиферацию [ 28 , 85 ]. Эта информация дополняется данными о дифференциальной экспрессии генов, связанных с клеточным циклом. Так, было показано, что в периферических клетках РПЭ доминируют гены, стимулирующие пролиферацию [ 57 ].

Помимо проявления пролиферативной активности in situ, клетки РПЭ взрослых млекопитающих и человека могут активироваться к делению при помещении в культуру клеток, где их пролиферация облегчается потерей межклеточных контактов и различными факторами роста в культуральной среде. Предполагается, что пролиферация и амплификация клеток РПЭ in vitro происходит преимущественно за счет субпопуляции стволовых клеток (СК) в РПЭ [ 86 ].

Экспрессия маркеров мультипотентности и стволовых клеток в РПЭ является важным критерием, позволяющим отнести некоторые клетки РПЭ к взрослым СК. Однако для того, чтобы клетки можно было отнести к СК, они должны обладать рядом характеристик, таких как самообновление и генерация специализированного дифференцированного потомства. Самообновление — это способность СК пролиферировать симметрично или асимметрично и продуцировать аналогичные клетки [ 87 ]. Замена поврежденных или потерянных клеток во время регенерации происходит посредством различных механизмов, включая дедифференцировку, трансдифференцировку или репрограммирование [ 88 , 89 , 90 ]. Все три механизма можно наблюдать в слое РПЭ глаза позвоночных. Классические эксперименты на модельных животных показали способность клеток РПЭ трансдифференцироваться/перепрограммироваться в нервные клетки сетчатки, что успешно воспроизводится in vivo у низших позвоночных. Дедифференцировка — это переход окончательно дифференцированных клеток в менее дифференцированное состояние, в котором клетки могут делиться и в пределах своей клеточной линии локально заменять утраченные клетки, переходя к их окончательному дифференцированному состоянию у некоторых хвостатых амфибий [ 89 ]. Во время трансдифференцировки клеток RPE после повреждения сетчатки у этих животных уже дифференцированные клетки RPE меняют клон и перепрограммируются в нейрогенные предшественники, экспрессирующие Klf4, Sox2, Pax6 и c-Myc [ 89 ]. Потомки этих клеток-предшественников дифференцируются во все клетки сетчатки, включая фоторецепторы, глию и пигментный эпителий, а затем полностью восстанавливают функцию сетчатки у амфибий [ 89 , 91 , 92 , 93 ]. Повреждение сетчатки у млекопитающих и человека приводит к развитию патологий, сопровождающихся приобретением клетками РПЭ мезенхимального фенотипа [ 89 , 93 ]. Утрата межклеточных контактов запускает механизмы ЭМП. После накопления необходимого пула клеток-предшественников начинается ЭМП и дифференцировка в разные типы клеток. Некоторые исследователи проводят параллель между этими процессами в сетчатке и эмбриональным развитием, а также развитием опухолей [ 88 ]. В связи с этим у взрослых млекопитающих и человека трансдифференцировка РПЭ как средство регенерации сетчатки малоэффективна. Однако некоторые клетки РПЭ у млекопитающих могут проявлять пролиферацию, пластичность и преобразование в нейроны, что можно обнаружить in vitro [ 28 , 57 , 84 , 85].]. При репрограммировании in vitro полностью дифференцированная клетка может частично вернуться в свою плюрипотентную стадию, приобретя лишь некоторые характеристики СК, затем пролиферировать и дифференцироваться в другие типы клеток. У птиц и млекопитающих трансдифференцировка РПЭ в нейроны сетчатки происходит во время раннего эмбрионального развития только под влиянием основного фактора роста фибробластов (bFGF) или lin-28 [ 94 ].

В ряде исследований из РПЭ человека было выделено несколько клеток, которые согласно строгому клональному анализу и другим критериям стволовых клеток (самообновление и производство дифференциального потомства) были классифицированы как стволовые клетки взрослого РПЭ: РПЭСК. -производный RPE (RPESCs-RPE) [ 95 , 96 , 97 , 98 , 99 , 100 ]. Термин RPESCs-RPE был впервые предложен после того, как была показана способность RPESCs-RPE к мультипотентной дифференцировке в нервном и мезенхимальном (остеогенном, адипогенном и хондрогенном) направлениях [ 100 ].

Показано, что взрослый РПЭ in vitro может генерировать клетки, экспрессирующие маркеры клеток мезенхимального происхождения: мышечные, адипо-, остео- и хондрогенные клетки [ 100 ]. Чтобы исключить контаминацию и доказать мультипотентность стволовых клеток, авторы получили RPESC из первичного RPE человека путем клонирования одиночных клеток. Клетки помещали в разные культуральные лунки и подвергали воздействию среды для дифференцировки адипоцитов, хондроцитов и костей. Это исследование было проведено на клетках из различных источников, включая фетальный РПЭ человека, РПЭ различных видов млекопитающих, клетки ARPE-19 и клетки РПЭ, полученные из индуцированных плюрипотентных клеток и СК. Результаты данного исследования показали, что для РПЭ характерна мезенхимальная дифференцировка. Было обнаружено, что РПЭ плода человека наиболее устойчив к приобретению мезенхимальных судеб. В недавних исследованиях были изучены стволовые клетки фетального РПЭ (fRPESC), полученные под воздействием витамина С и вальпроевой кислоты [ 27 ]. Клетки fRPE и fRPESC были помещены в адипогенную, хондрогенную и остеогенную среду дифференцировки, чтобы проверить их способность к мезенхимальной дифференцировке. Окрашивание клеток специфическими маркерами и количественная ПЦР в реальном времени показали, что fRPESC более способны к дифференцировке в адипоциты, хондроциты и в остеогенном направлении, чем клетки fRPES. Была выявлена ​​регуляторная роль SOX2 в клеточной конверсии fRPESC и показано, что fRPESC теряют способность к мезенхимальной дифференцировке после нокдауна SOX2 [ 27 ]. Наряду с дифференцировкой РПЭСК в мезенхимальном направлении in vitro, из многолетних патоморфологических наблюдений хорошо известно, что в глазах человека иногда обнаруживаются хрящевые и костные образования, развивающиеся из клеток РПЭ [ 100 , 101 , 102 ]. Эти данные указывают на то, что RPESCs имеют широкий репертуар дифференцировок, напоминающий таковой у клеток нервного гребня [ 103 ]. Можно предположить, что эта мультипотентность RPESCs может быть каким-то образом связана с очень ранним высвобождением нейроэпителиальных клеток-предшественников RPE во время эмбриогенеза.

Сведения о дифференцировке РПЭСК в нейральном направлении в глазах млекопитающих и человека in vivo отсутствуют, тогда как развитие в мезенхимальном направлении с образованием эпиретинальных мембран при патологиях сетчатки является общеизвестным медицинским фактом [ 100 , 104 ]. .

More than 20 years ago, the researchers' laboratory established that in the total population of RPE cells of the adult human eye, the pluripotency genes OCT4, NANOG, and SOX2 are expressed, as well as the neural differentiation gene PAX6, which was identified in the RPE during embryonic development, indicating that a certain proportion of cells with stem/progenitor properties are possibly present in the RPE [105,106,107]. Subsequent studies of the behavior of adult and fetal RPE cells in vitro showed that cells in culture dedifferentiate and express stem cell and poorly differentiated cell markers OCT4, NANOG, SOX2, PAX6, and PROX1. Under in vitro differentiation conditions, the cells express neural and glial cell markers such as NESTIN, MSI1, βIII-Tubulin, neurofilaments (68–200 kDa), and GFAP. In addition, using immunostaining, markers of mature retinal and brain cells were detected: recoverin (photoreceptor marker), dopaminergic neuron markers, tyrosine hydroxylase (TH) (retinal amacrine cell marker), GABAergic interneuron markers, nNOS (retinal amacrine or ganglion cell marker), as well as CNPase and O4 (oligodendrocyte markers).

The native human RPE and cell culture have been characterized by the expression of stem cell markers, including NANOG, OCT4, SOX2, SSEA-4, KLF4, C-MYC, and LIN-28. Cultured RPE cells were positive for the surface marker SSEA4, showed little reaction to SOX2 immunostaining, and showed no immunostaining for OCT4 and NANOG [100]. It was found that the combined effect of vitamin C and valproic acid activates the expression of the retinal progenitor markers MITF, OTX2, and PAX6, as well as the mesenchymal stromal markers CD133, CD73, CD105, and CD90 in fRPE cells. As a result, the cells enter a retinal stem cell-like state (fRPESCs). Researchers believe that a high expression of SOX2 in fRPESCs is a prerequisite for maintaining retinal stem cell properties and a multipotent differentiation potential [27].

The search for and study of the stem properties of the RPE continues, using modern molecular genetic technologies. Among the identified mouse RPE clusters, researchers paid special attention to cluster C1, containing only 1–2% of the total number of cells [67], and cluster 5, in which only 19 cells (0.59%) were found [26], which were cells with the characteristics of stem cells and/or progenitor cells. In these clusters, a high expression of stemness and stem cell maintenance genes was observed, against the background of a high expression of melanogenesis genes. This indicated that the cells were still in the process of differentiation. It was also found that there was a high correlation of gene expression between RPE cells of the C1 cluster and retinal cells, which possibly pointed to the ability of C1 cells to differentiate into different cell types of the neural retina [67]. In addition, it was demonstrated that the RPE cells in the adult mouse eye are epigenetically very similar to the phenotypes of retinal progenitor cells and photoreceptors [111].

Mouse RPESCs were induced in vitro through the stage of sphere formation (sphere-induced RPE stem cells, iRPESCs) and it was discovered that the gene expression profile of iRPESCs was very different from the parental RPE. At the same time, changes in gene expression occurred immediately after the formation of spheres. Mouse iRPESCs expressed increased levels of c-Myc, Oct4, c-Kit, and Cd44 [96]. The expression of eight of the fifteen selected stemness genes, such as Klf4, Alpl, Kit, Kitl, and Bmi1, was significantly upregulated in RPE spheres, and the expression of Abcg2, Bmi1, Cd44, Kitl, and c-Myc was upregulated in iRPESCs, compared with the original RPE. Two DNA methylation genes (Dnmt1 and Dnmt3a), four histone acetylation genes (Hat1, P300, Myst2, and Myst3), and seven deacetylation genes (Sirt2, Sirt6, Hdac1, Hdac2, Hdac3, Hdac5, and Hdac6) were highly expressed in the stem cells, reflecting epigenetic regulation that may promote the expression of major stemness genes, such as Oct4 and Klf4 in iRPESCs [96,112].

The proliferation of human RPESCs was stimulated by cultivating them in a free-floating state with the addition of growth factors, similar to neural stem cells (NSCs) [100,105,106,110]. The mouse RPE cells were cultivated in the form of spheres to obtain induced iRPESCs [96]. The RPE cells were cloned in adherent cultures to expand the number of RPESCs [98], using protocols for isolating and culturing RPESCs from previous studies [95,97,99,113,114]. The human fetal RPE was treated with vitamin C and valproic acid; the stemness properties of the resulting fetal RPESCs (fRPESCs) were studied, and a significant increase in the stem cell markers SOX2, OCT4, and KLF4 was found [27]. In another study, RPESCs were activated by the influence of amniotic fluid factors, and the retinal progenitor cells obtained in this way were studied [115]. From the above studies, it follows that in the adult human and mouse RPE, cells are preserved that have signs of SCs that can be identified in vitro.

Clonal analysis of adult RPE cells was used and it was shown that primary spheres from free-floating cells were formed after 4 days with a frequency of 1.5% of the number of initial seeded cells [100]. In the adherent cultures, about 10.6% of the cells actively proliferated, although the vast majority did not divide or produced only limited progeny [100]. It was found that 10% of RPE cells proliferate once in culture, using the clonal plating. Among RPE cells, only 2% of cells proliferate very actively and can create up to 90% of the entire monolayer. These cells were classified as RPESCs [98]. If mouse RPE cells are cultured through the sphere formation stage, approximately 0.003–0.013% of RPESCs can be activated. These cells actively proliferated for more than ten passages, in contrast to other RPE cells, which showed limited proliferation and senescence after only five passages [27].

In studies of the mechanism of entry of human RPE cells into the phase of DNA synthesis in vitro, it was found that mitogen-activated protein kinase (MAPK) and extracellular signal-regulated kinase (ERK) play a key role. In this signaling pathway, growth factor receptor activates Ras GTPase, leading to MAPK/ERK phosphorylation. The MAPK/ERK signaling pathway, in turn, regulates transcription factors, c-myc, Pax6, klf4, and MITF, the expression of which indicates a decrease in the level of RPE differentiation [86,116]. Several growth factors, such as Vegf, Tgf, Pdgf, Egf, and Ngf; their receptors, Vegfr, Egfr, Pdgfr, and Tlk4; and two stem cell-associated signaling ligands, Kit-l and Lif, are involved in RPE reprogramming into induced iRPESCs and are highly expressed in iRPESCs. The ability to proliferate has been shown to be maintained through the persistent repression of cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI) genes, including p16, Arf, p21, and p57, which were expressed at very low levels in the RPESCs, compared with their parental RPE cells [96].

From the above studies, it follows that among the heterogeneous RPE cells of mice and humans, 0.003–2% of cells can be distinguished that are capable of proliferation, self-maintenance, and the expression of specific genes characterizing the state of stemness in cells. These cells may remain quiescent or exhibit multipotent differentiation into a mature cell type. Under expansion culture conditions in which RPESCs self-renew, they generate SC progeny, and, conversely, under differentiation culture conditions, RPESCs generate progeny of different cell types. RPESCs can produce RPE cells, and epithelial monolayers of RPE cells are easily obtained. In in vitro differentiated media that activate neural or mesenchymal differentiation, RPESCs can generate both neuronal and mesenchymal cells [86,100].

Using qPCR analysis and immunostaining, it was shown that under in vitro differentiation conditions, the RPE cells of embryonic and adult human eyes express markers of progenitor and neural cells [105,106,108,109,110]. Other researchers have found photoreceptor markers in RPE cell lines and primary RPE cultures, such as Crx10 [117], Opn3, Opn4, Nrl, Crx, Opn1mw/1w, Sag, Nr2e3, and recoverin [118]. The identification of the recoverin protein suggests that human RPE cells are capable of differentiating into retinal photoreceptor-like cells. In that study, the human RPE cells were cultured in a medium that promotes the differentiation of retinal neurons [100]. Using qPCR analysis, it was shown that the expression of the neural progenitor marker NES and the neuronal marker TUBB3 was significantly activated in RPE cells (over 1000-fold and 90-fold, respectively). Interestingly, under these conditions, the cells increased the expression of the eye field marker genes LHX2, OTX2, and RX, which are characteristic of the early stages of eye development, while the levels of retinal progenitor markers CHX10 and RHO did not change, and the expression of PAX6 actually decreased. These culture conditions have been noted to promote the differentiation of RPESCs toward neural progenitors of the forebrain and retina [100].

The directed differentiation of human fRPESCs into photoreceptors using a special three-step protocol using different culture systems and media has been carried out [27]. During the process of differentiation, the fRPESCs changed their morphology, first forming a round shape and then extending several synapse-like structures to finally form a tubular rod-shaped structure resembling the outer segment of a photoreceptor. At the first stage of differentiation, retinal photoreceptor progenitor cells with the expression of markers PAX6 and VSX2 were obtained. At the second stage, the cells were differentiated into photoreceptor progenitors that significantly increased the expression of photoreceptor markers NRL and CRX. Finally, at the terminal stage of RPESC differentiation, rod photoreceptor cells expressing REC, RHO, ARRESTIN, and GNAT1 were obtained [27]. Another study managed to differentiate fetal RPE cells into rod photoreceptors by chemical reprogramming [14]. Gene ontology analysis of RNA sequencing results from these cells revealed the upregulation of genes involved in neuronal generation, neurotransmitter uptake, and photoreceptor cell differentiation, such as SOX8, IGFN1, ASCL1, RXRG, THRB, and RORB. On day 10 of reprogramming, the transcriptome profile showed a stable activation of genes specific to rod photoreceptors, but not to cones [14].

Mouse and human RPE stem cells are capable of redifferentiating to the original phenotype. The sphere-derived dedifferentiated RPESC-like cells can differentiate back into RPE cells in vitro [27,116]. Monolayer cultures of RPE cells derived from human RPESCs have been described and characterized as cultures with the morphology and physiology characteristic of the native RPE [95,97,99,113,114]. The redifferentiation of RPESCs occurs within 8 weeks of cultivation. During this time, the cells change their morphology, proliferation rate, and polarization and also acquire the key phenotypic characteristics of the RPE. In cultured spindle-shaped RPESCs, a significant decrease in proliferation was observed after 2 weeks; after 4 weeks, the appearance of islets of cells with a cuboidal morphology was noted, and, by week 8, almost all cells acquired the morphology of a mature RPE. The secretion of vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) through the apical and basement membranes increased from week 2 to week 4, while the secretion of pigment epithelium-derived factor (PEDF) appeared during week 6 of the cell differentiation [95,97,99]. In the cultured adult RPE, a similar but sometimes increased expression of RPE markers was observed, compared with the native tissue. Claudin-19 was present along the apical–lateral membrane along with the tight junction protein ZO-1, indicating the existence of a functional epithelial barrier. Ezrin, a membrane-associated protein involved in cytoskeletal organization, was found predominantly in the RPE microvilli. The visual cycle proteins, cellular retinaldehyde-binding protein (CRALBP) and RPE65, were localized, as expected, in the cytoplasm. Monocarboxylate transporter 1 (MCT1) was present on the apical surface of cells [98]. This indicates the establishment of the polarity characteristic of mature RPE cells. It is obvious that, in mouse and human RPEs, cells with stem properties are present, which also have the ability to redifferentiate to the original phenotype of RPE cells.

Throughout the entire period of differentiation, the RPESC-RPE cells continuously expressed pigment epithelium cell fate determination factors OTX2 and MITF and did not express smooth muscle actin, an indicator of epithelial–mesenchymal transition. It has been shown that, during the differentiation period, transepithelial resistance increases and reaches the norm [95,99]. However, the phagocytic activity of RPESC-RPE cells decreased after 4 weeks of differentiation, apparently due to a lack of contact with photoreceptors, which are necessary for the full maturation of the RPE [97].

RNA-Seq and scRNA-Seq on differentiated RPE cells derived in vitro from human RPESCs identified 13 cell subpopulations with different functional specializations. The transcriptomic analysis showed that the subpopulation composition of the entire RPE cell population is subject to dynamics over time. These findings suggest that RPE subpopulations have overlapping but distinct functional profiles. Among these subpopulations, there are ten profiles in number. In these cells, the specific marker EZH2 (a transcription factor involved in histone methylation, self-renewal, and the differentiation of SCs) was isolated, indicating a state similar to stem cells or progenitor cells [71]. This study has confirmed RPE heterogeneity under culture conditions, similar to the native tissue, and answered the previously raised question about the innate differences between RPE cells, and whether a trait can be accurately passed on to daughter cells in the reproducing population [31]. It is likely that the mosaicism of RPE cells is hereditary in nature, embedded in the genetic program of the cells themselves, and conditioned by epigenetic influence.

Retinal degeneration as a result of the death of photoreceptors and RPE is the main cause of many degenerative diseases of the human eye, leading to vision loss [119]. For vision correction during this kind of pathology, approaches are currently being actively developed in contemporary medicine, aimed at preserving the original photoreceptors and RPE [120] and/or striving to replace cells by activating endogenous regeneration [121] or through cell transplantation [120,122]. One approach to treating a number of degenerative retinal diseases, including age-related macular degeneration, is cell replacement therapy. RPE cells derived from human embryonic SCs and iPSCs are already undergoing clinical trials and have great promise for the treatment of both age-related macular degeneration [123,124,125] and hereditary RPE-associated retinal dystrophies [126]. Despite the highly effective protocols for obtaining RPE cells in sufficient quantities for transplantations that have been developed, they still remain labor- and time-consuming [127]. In addition, there is the problem of immunosuppression and tumorigenesis [128,129], and moral and ethical issues regarding the use of ESCs remain unresolved [130].

В отличие от ESCs и iPSCs, RPESCs взрослого человека, несмотря на их ограниченный пролиферативный потенциал, не образуют опухоли [ 100 ]. РПЭСК способны производить потомство РПЭ-РПЭС, которое по морфологическим и функциональным характеристикам соответствует нативному РПЭ [ 95 , 97 , 99 , 113 , 114 ]. Доклиническая трансплантация РПЭ, полученного из РПЭСК, показала, что промежуточная стадия дифференцировки РПЭ более эффективна для восстановления зрения [ 97 ]. Успешная трансплантация человеческих fRPESCs была продемонстрирована на животных моделях, где клетки дифференцировались как в RPE, так и в фоторецепторы [ 27 ].

Гетерогенность РПЭ-РПЭСК проявляется не только в функциональной специализации клеток, но и в способности РПЭ-РПЭСК успешно трансплантироваться. Было идентифицировано несколько субпопуляций RPE-RPESCs, которые могут быть потенциальными кандидатами на эффективную трансплантацию [ 71 ]. Эти клетки показали обогащение сигнальных путей, связанных с дифференцировкой и пролиферацией клеток. Тем не менее, среди них был выделен только один кластер EZH2-позитивных РПЭ-РПЭСК, способный интегрироваться в монослой РПЭ хозяина при трансплантации. Выявлена ​​четкая разница между транскриптомами трансплантоэффективных и трансплантонеэффективных субпопуляций RPE-RPESC. Кроме того, были показаны молекулярные пути, связанные с эффективностью трансплантата, и установлены потенциальные биомаркеры для эффективных культур РПЭ [ 71 ]. В качестве первичного биомаркера успеха трансплантации рассматривалась длинная некодирующая РНК (днРНК) Three Prime Repair Exonuclease 1 (TREX), которая регулирует различные клеточные процессы, включая миграцию и выживание клеток [ 71 ]. Эти данные позволят нам выделить из гетерогенных популяций РПЭСК-РПЭ, иПСК-РПЭ, ЭСК-РПЭ и РПЭ, полученных из других возможных источников клеток, отдельную субпопуляцию клеток, наиболее подходящую для успешной трансплантации.

В настоящее время RPE, полученный из RPESC, представляет собой потенциально неограниченный источник HLA-совместимых клеток и неограниченный источник доноров с несколькими качествами, благоприятными для трансплантации, включая стабильность, повсеместное распространение и стоимость. Кроме того, активные клинические исследования фазы 1 проводятся у пациентов с сухой ВМД (NCT04627428) [ 131 ]. Важно отметить, что трансплантация может вызвать ряд осложнений, которые могут быть спровоцированы хирургическим повреждением сетчатки, приводящим к ее отслойке [ 132 ]. В связи с этим стимуляция эндогенных взрослых РПЭСК, присутствующих в глазу, для получения нового аутологичного РПЭ in situ без хирургического вмешательства может быть перспективной для лечения многих дегенеративно-дистрофических заболеваний сетчатки человека и поможет избежать вышеперечисленных ограничений и осложнений. .