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Subjects:
Biotechnology & Applied Microbiology
单细胞测序 (scRNA-seq) 彻底改变了我们在单细胞水平探索异质性和遗传变异的能力，为理解疾病机制和细胞间相互作用开辟了新途径。单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 因其减少的电离转录偏差以及与更丰富的样品的兼容性而成为 scRNA-seq 的一种有前途的解决方案。
- FFPE
- snRNA-seq
- nuclear preparation strategies
一、简介
检测单个细胞中的基因表达可以识别细胞类型和细胞状态。自从 Tang 在 2009 年开发出单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)（参考单细胞的 mRNA-Seq 全转录组分析）以来，它已经取代bulk RNA-sq 成为研究细胞转录谱的强大工具 [ 1]。然而，scRNA-seq 所需的细胞解离方法会导致基因表达和细胞死亡的实验变化。此外，许多有价值的样本无法以新鲜组织和冷冻样本的形式获得，从而限制了对档案和生物样本库材料的研究。单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 通过分析细胞核而不是整个细胞，成为 scRNA-seq 的一种有吸引力的替代方案，由于可以准确识别细胞类型，减少解离，因此可以研究冷冻或难以解离的组织-诱导转录以发现未知和稀有的细胞亚群。此外，snRNA-seq 减少了细胞覆盖率的偏差，可应用于存档的冷冻样本 [ 2]，并且不易受到细胞分离过程中发生的基因表达扰动的影响，例如掩盖神经元活动转录特征的直接早期基因的表达增加[ 3 ]。
尽管新鲜或新鲜冷冻临床样品是转录组分析的理想选择，但这些样品的可用性有限是一个严重的缺点。福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织块代表了临床诊断中保存人体组织的重要方法 [ 4 ]。在全球范围内，病理实验室和样本库拥有超过 10 亿个 FFPE 切片。这些存储库为深入的转录组分析提供了宝贵的资源，尽管只能在样本收集后几周到几年内访问。这种延迟是由于关键的临床属性所必需的，例如肿瘤遗传学、治疗反应和患者生存，这些属性需要足够的时间来进行有意义的开发[ 5]。sc/snRNA-seq 与 FFPE 样品的兼容性使研究人员能够研究组织细胞异质性的各个方面 [ 6 , 7 ]。最近，sc/snRNA-seq 化学技术已开发用于 FFPE 单细胞/细胞核悬浮液，结果表明，这允许对从FFPE 组织样本中分离的细胞核进行 sc / snRNA-seq [ 8,9,10,11 , [图12 ]在读取深度下，与新鲜或冷冻细胞悬浮液相比，允许进行类似的细粒度分析。
2. FFPE 组织中细胞核的分离策略和应用
临床 FFPE 标本中每个细胞的准确转录组特征被认为可以更好地了解细胞异质性和群体动态，从而提高人类疾病的准确诊断、治疗和预后。sc/snRNA-seq 在 FFPE 样品中的应用的前提是获得优质的单细胞或单核悬浮液。然而，由于甲醛固定引起的 RNA 交联、修饰和降解，完整单细胞/细胞核的分离仍然具有挑战性。尽管有用于 FFPE 样品的市售试剂盒（Miltenyi Biotech FFPE Tissues Dissociation Kit），但强烈建议对 FFPE 组织进行 snRNA-seq 而不是 scRNA-seq，因为固定过程通常会破坏各种细胞结构的完整性，16 ]。FFPE样品核的制备方法由来已久，主要分为两类：（I）酶解策略和（II）机械提取策略。
2.1. 酶解策略
FFPE 组织的核解离方法可以追溯到上世纪。这些方案共享 FFPE 载玻片脱蜡和补水的通用程序，但它们在所用消化酶的类型或浓度以及所用反应条件方面有所不同。赫德利等人。1983 年首次描述了从存档组织中释放细胞核 [ 17 ]，并使用流式细胞术 (FCM) 测量了 FFPE 人类肿瘤的细胞 DNA 含量。具体而言，将 FFPE 切片在胃蛋白酶解离溶液（0.5% 胃蛋白酶、0.9% NaCl、2N HCl）中于 37°C 孵育 30 分钟，以制备细胞核悬浮液。从那时起，这个协议[ 17]经过多次修改和改进，以适用于石蜡包埋材料，并应用于DNA探针的原位杂交（ISH）[ 18 ]，以及荧光原位杂交（FISH）[ 19,20,21,22 ] ]。
分离 FFPE 细胞核的方法有多种，其中大多数用于 FISH。2012 年，迈克尔等人。[ 25 ]应用基于流式细胞术的方法从FFPE组织中分离出纯的肿瘤细胞核群体。他们开发了一种与寡核苷酸阵列比较基因组杂交（aCGH）和全外显子组测序（WES）分析兼容的方法。具体地，通过在EDTA溶液中加热，然后用CaCl 2洗涤，使FFPE卷轴去交联；然后，在多种酶（3型胶原酶、纯化胶原酶和透明质酸酶）的混合解离溶液中进行过夜消化。然后将所得颗粒通过 25 G 针约 10-20 次。
2.2. 机械萃取策略
最近，Regev 等人。使用 snFFPE-Seq 技术中冷冻样品的传统方法从 FFPE 样品中提取细胞核 [ 10]。他们首先开发了一种方案，通过优化脱蜡和再水化过程，从小鼠大脑的 FFPE 样本中获得完整的细胞核悬浮液。具体来说，他们使用了 50 µm 的皮层区域卷轴，并测试了三种脱蜡处理：加热矿物油 (80 °C)、加热二甲苯 (90 °C) 和室温二甲苯。然后使用先前开发的裂解缓冲液进行细胞核提取，该裂解缓冲液保留了核糖体与核膜的附着，从而增加了捕获的 RNA 分子的产量。与此同时，马特洛托等人。进行了一项研究，涉及酶解和机械提取相结合，从 FFPE 乳腺癌转移到肝脏中分离细胞核 [ 9]。他们遵循迈克尔等人开发的核解离方案。处理 25 μm FFPE 切片 [ 25 ]。随后，按照与用于冷冻样品的成核过程相同的步骤，将组织在 Ez 裂解缓冲液中匀浆。
总的来说，与其他技术相比，酶解方法更容易处理，并产生更多数量的完整细胞核，因为它们涉及更少的组织碎片，并且不需要多步骤过滤。然而，通过这种方法获得的细胞核主要用于 FISH 和 DNA 拷贝数分析。转录组分析的这种有限用途可归因于 FFPE 样品的长期高温处理导致细胞核内 RNA 的大量降解。此外，长时间暴露于酶缓冲液中可能会增加核膜的渗透性，导致 RNA 分子泄漏，并对液滴中进行的 snRNA-seq 实验产生不利影响。
3. FFPE 组织单核测序技术的潜在发展
近年来，高通量 sc/snRNA-seq 方法彻底改变了生物医学研究领域。临床 FFPE 标本中单细胞转录组学的准确表征对于增强我们对细胞异质性和群体动态的理解，从而提高人类疾病的精确诊断、治疗和预后具有很大的希望。然而，现有的高通量 sc/snRNA-seq 平台不适合 PFA 固定和 FFPE 样品。之前对 FFPE 样品的转录组研究主要依赖于低通量 microRNA 扩增测定。最近，10× Genomics 和 M20 Genomics 宣布了专为 FFPE 样本设计的 sc/snRNA-seq 策略，这标志着存档 FFPE 样本的高效转录组分析取得了重大进展。
3.1. 基于A尾捕获
在真核生物中，具有多腺苷酸化（Poly-A）的RNA包括mRNA和长链非编码RNA（lncRNA），仅占RNA总量的1-5%。基于互补碱基配对的原理，研究人员设计了oligo-dT探针，以达到从总RNA中捕获聚腺苷酸化RNA的目的（图1A）。
图 1.基于 Oligo-dT 探针捕获技术的 FFPE 样品的 sc/snRNA-seq。( A ) 传统的 3' 测序文库构建原理（例如 10×、drop-seq、AccuraCell™）。( B )Smart-3SEQ文库制备方法概念图。经参考文献许可转载。[ 31 ]。版权所有 2019 基因组研究。RNA 因水解而变性并断裂；oligo(dT) 引物捕获多聚 dA；合成第一链cDNA和第二链cDNA；使用长引物进行 PCR 扩增，并使用 SPRI 珠进行净化步骤；最终文库包含两个测序接头之间的未知 cDNA 序列。( C ) Smart-seq-total 管道示意图。经参考文献许可转载。[ 32]。版权所有 2021 美国国家科学院院刊。细胞裂解，总RNA被聚腺苷酸化，用锚定的oligo-dT引发；反转录后，TSO被酶切，单链cDNA被扩增并清理；然后，扩增的 cDNA 被标记或直接索引、汇集并从核糖体序列中去除。( D ) VASA-seq 单细胞分子工作流程概述。经参考文献许可转载。[ 36 ]。版权所有 2022 自然生物技术。单细胞裂解，RNA片段化；片段被修复并聚腺苷酸化，然后使用带条形码的oligo-dT引物进行逆转录（RT）；将 cDNA 制成双链并使用 IVT 进行扩增；aRNA 中的 rRNA 被耗尽，文库通过连接、RT 和 PCR 完成，留下可供测序的片段。
2016 年，Levi, BP [ 30 ] 开发了固定和恢复的完整单细胞 RNA (FRISCR)，它结合了反向交联、用于 RNA 纯度的 dT 25珠子和 Smart-seq2 来分析个体固定、染色和分选的转录组细胞。结果表明，固定和纯化引入的偏差最小，并产生与活细胞相似的基因表达数据。据报道，Smart-3SEQ [ 31 ]可用于 FFPE 样品的单细胞检测（图 1B）。然而，这些基于孔板的方法与 PFA 固定的细胞兼容，但吞吐量相对较低，限制了它们在广泛细胞群体中寻找稀有表型的适用性。一种称为 scifi-RNA-seq（“单细胞组合流体索引”RNA-seq）的高通量 scRNA-seq 方法已被开发出来[ 33 ]，它将基于孔板的组合索引与 10× 平台相结合。它已被证明适用于甲醛固定的单细胞/细胞核，尽管它在液滴封装之前需要单独的逆转录步骤，这使样品处理变得复杂。VASA-seq（通过 dA 加尾对单细胞进行大规模转录组分析）结合了 Smart-3SEQ 和 Smart-total-seq（图 1）C) 检测单细胞/细胞核中的总转录组（图 1 D）。该方法能够使用板和液滴微流体格式捕获整个长度上的非聚腺苷酸化和聚腺苷酸化转录本。然而，利用该技术实现高通量检测需要建立两套微流控系统。2022 年，Regev, A. 等人。提出了 snFFPE-Seq [ 10 ]，这是一种对 FFPE 样品进行 snRNA-Seq（10× 基因组学）的方法（图 1）A）。该方法优化了基于平板和基于液滴的 snRNA-seq 过程的多个阶段，包括组织脱蜡和补液、完整细胞核提取以及去交联和脱蛋白。他们对 FFPE 细胞核应用了一种方法，涉及利用不耐热蛋白酶 K 对室温下从 FFPE 组织中提取的细胞核悬浮液进行脱蛋白和去交联。随后，蛋白酶被热灭活，并且在加载到基于液滴的平台之前，细胞核被部分反向交联。
3.2. 目标探针捕获
虽然聚腺苷酸捕获目前是商业平台中流行的 mRNA 富集方法，但其实用性在发生样品降解的情况下受到限制。与多聚腺苷酸捕获相反，基因探针方法与目标基因进行分子杂交，产生杂交信号。该信号有助于在广泛的基因组中可视化目标基因，从而成为研究以广泛碎片化 RNA 为特征的样本中转录组学的有效方法。基因探针捕获技术旨在捕获并杂交细胞核内的目标 mRNA 片段，使其特别适合由可降解组织组成的样本。
TempO-Seq（Templated Oligo Assay with Sequencing Readout）[ 37 ]是一种基于连接的靶向全转录组表达谱分析，用于识别以前未报告的化合物反应基因，并将它们纳入全面但具体的化合物特征中（图 2 A）。MLPA-seq [ 43] 是著名的 MLPA（多重连接依赖性探针扩增）方法的增强版本。这两种方法都克服了原始 MLPA 在复用和检测方面的局限性。他们利用 NGS（下一代测序）的灵敏度来分析多达 20,000 个目标 RNA。然而，这些方法高估了研究分子的原始数量，并且存在 PCR 扩增引起的偏差。相比之下，TAC-seq（通过测序进行靶向等位基因计数）[ 39 ]方法采用UMI来估计mRNA的原始分子计数，可以克服NGS中的扩增偏差并最大限度地提高核酸检测灵敏度（图2）B）。尽管如此，上述技术都无法促进 FFPE 样品的高通量 snRNA-seq。最近，10× Genomics 推出了针对 FFPE 样品的 Chromium 固定 RNA 分析 (Fixed-RNA)（图 2 C）。
图 2.基于基因探针捕获技术的 FFPE 样品的 sc/snRNA-seq。( A ) TempO-Seq 生化 LOS 方案。经参考文献许可转载。[ 37 ]。版权所有 2017 PLOS ONE。RNA 通过与包含靶标特异性序列（绿色）以及所有 Dos 共享的引物着陆位点（红色和黄色）的 DO 退火来靶向；多余的寡核苷酸被 30 核酸外切酶去除，然后使用包含样品标签（索引）序列（橙色和紫色条）和测序所需的接头的引物连接和扩增杂交的寡核苷酸。( B ) 检测特定 mRNA 或游离 DNA 的测定示意图。经参考文献许可转载。[ 39]。版权所有 2018 基因组医学。目标特异性 DNA 寡核苷酸检测探针在严格条件下与所研究的 cDNA 或 cfDNA 杂交；两种检测寡核苷酸均由特定的 27 bp 区域（绿色）、4 bp 独特分子标识符 (UMI) 和通用序列（紫色和橙色）组成；正确的检测寡核苷酸是 5' 磷酸化的。严格杂交后，使用耐热连接酶在严格条件下连接检测探针对；接下来，用磁珠捕获与目标区域复合的连接检测器，并进行 PCR 扩增，以引入单读 NGS 所需的样本特异性条形码和其他常见基序。（C) Chromium 单细胞固定 RNA 分析文库构建原理。细胞被固定并透化；样品与探针组杂交，可以单独处理，也可以在 Chromium 芯片的单泳道中合并最多 16 个样品；在 GEM 生成过程中，探针组被连接并延伸以包含独特的条形码。然后制备测序文库、测序并分析。
3.3. 随机引物捕获技术
随机引物法是一种常见的分子生物技术，主要用于扩增特定的RNA片段。由于随机引物的任意性，任何长度的RNA序列都可以被扩增，进而适合FFPE样品的转录组学研究。
基于分池连接的转录组测序 (SPLiT-seq) [ 40 ] 是一种通过组合条形码标记 RNA 细胞起源的 scRNA-seq 方法，已成功用于固定细胞，使用随机引物，捕获效率更高、捕获范围更广总RNA[ 44 ]。scFAST-seq（单细胞全长RNA序列转录组测序）[ 41 ]，一种结合半随机引物、高反转录效率、模板切换和便捷的rRNA去除方法的方法，可以构建全长RNA 8 小时内多达 12,000 个细胞的 RNA 文库（图 3A）。尽管该技术目前与 FFPE 样品不兼容，但它有可能应用于固定或石蜡包埋的样品。与Fixed-RNA（10× Genomics）并行，M20 Genomics推出了基于随机引物的单核全长转录组扩增技术，可以从RNA不完整样本中扩增转录本，适用于FFPE样本中的snRNA-seq。基于这种方法，王和郭等人。开发了一种针对 FFPE 组织的基于液滴的 snRNA 测序技术（snRandom-seq）[ 12 ]，通过随机引物捕获全长总 RNA，为临床 FFPE 标本提供了强大的 snRNA-seq 平台（图3 B）。
图 3.基于随机探针捕获技术的 FFPE 样品的 sc/snRNA-seq。( A ) scFAST-seq 的建库原理。将细胞悬浮在逆转录主混合物中，然后用带有细胞条形码的凝胶珠封装到液滴中；从每个细胞释放的RNA被反转录为cDNA，并通过相应的半随机体进行条形码标记，并通过液滴内的模板转换寡核苷酸进行加尾；打碎液滴后，所有液滴中汇集的 cDNA 均被纯化并扩增，而来自 rRNA 和 mtRNA 的 cDNA 的扩增则被封闭探针抑制；然后，建设图书馆。( B ) FFPE 组织的 snRandom-seq 工作流程。经参考文献许可转载。[ 12]。版权所有 2023 自然通讯。FFPE 样品选择、石蜡溶解、单核分离和透化、单链 DNA 封闭、逆转录、dA 加尾、液滴条形码、引物释放和延伸、液滴断裂和 PCR 扩增以及测序。
This entry is adapted from the peer-reviewed paper 10.3390/ijms241813744
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